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二代、三代测序软件及分析流程整理

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测序软件使用记录

二代、三代测序软件及分析流程整理

二代测序拼接软件

SPAdes

该软件是最常用的二代测序拼接软件。速度虽然没有soapdenovo快，但是结果似乎更加可靠，并且考虑到SOAPdenovo多年没有更新，SPAdes应该为首选。

另外，SPAdes 软件不仅支持 illumina 测序数据，还可用于Ion Torrent测序数据，PacBio测序数据、sanger 数据，Nanopore数据。并且可以加入其它拼接结果以作为辅助拼接（Hybrid）。

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spades.py -1 illumina_ninanjie_1_clean.fastq.gz -2 illumina_ninanjie_2_clean.fastq.gz -o spades_illumina -t 24

SOAPdenovo

SOAPdenovo 是由华大基因开发的 SOAP 软件包的一部分，主要用于短序列 reads 拼接，尤其是 illumina 测序数据。但已长时间无人维护。

二代测序流程

  1. 获取测序数据
  2. fastqc 质控
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fastqc -f fastq -o illumina_qc/ illumina_ninanjie_1.fastq.gz illumina_ninanjie_2.fastq.gz
  1. fastp去除质量不好的位点
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fastp -i ../illumina_ninanjie_1.fastq.gz -o ../illumina_ninanjie_1_clean.fastq.gz -I ../illumina_ninanjie_2.fastq.gz -O ../illumina_ninanjie_2_clean.fastq.gz -z 4 -q 20 -u 30 -n 10 -f 20 -t 10 -F 20 -T 10 -h clean.html
  1. 再次fastqc质控得到clean的数据
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fastqc -f fastq -o illumina_clean_qc/ illumina_ninanjie_1_clean.fastq.gz illumina_ninanjie_2_clean.fastq.gz
  1. 使用二代测序拼接软件对clean数据进行拼接
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spades.py -1 illumina_ninanjie_1_clean.fastq.gz -2 illumina_ninanjie_2_clean.fastq.gz -o spades_illumina -t 24
  1. 纠错

三代测序拼接软件

flye（适合Pacbio和Nanopore）

flye 原来叫做abruijn，是一款适合单分子测序的拼接软件，适合处理Pacbio与Nanopore数据。flye 适合拼接多种数据集，从小的细菌基因组到很大的哺乳动物基因组都可以完成。

flye 其实是一个完整的拼接流程，原始测序数据作为输入，最后就可以直接输出经过纠错校正的基因组序列，同时，flye 也有一个独立的模块可以用来拼接宏基因组。

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flye --nano-raw nanopore_ninanjie.fastq.gz -g 120m -t 12 -o flye_nano

canu（适合Pacbio和Nanopore）

canu 是一款三代测序数据拼接软件，适用于 Pacbio 与 Nanopore 测序数据。canu 软件其实具有悠久的历史，虽然只发表于 2017 年，但其源于著名的 Celera Assembler。Celera Assembler 主要用于一代测序，现在已不再更新。canu 延续了Celera Assembler工具的组装原理，专门用于三代长读长以及错误率较高的测序的结果组装。canu软件缺点是非常消耗资源，拼接比较耗时，默认会使用所有 CPU。

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canu -d canu -p canu genomeSize=5.4m maxThreads=24 -nanopore-raw ../data/clean.filtlong.fq.gz

wtdbg2（适合Pacbio和Nanopore）

wtdbg2是阮珏写的另外一个拼接软件，可以用于 PacBio 或Nanopore的数据拼接，该软件无需纠错直接进行拼接，然后生成一致性序列。wtdbg2运行速度比 canu 和 falcon 都要快很多。能够拼接人全基因组序列，甚至是32Gb的蝾螈基因组。

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wtdbg2.pl -t 12 -x ont -g 5.4m -o wtdbg2 ../data/clean.filtlong.fq.gz

三代测序流程

  1. 获取测序数据
  2. 质控（Nanopore使用nanoplot进行质控）
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NanoPlot --fastq nanopore.fastq.gz -o nanoplot
  1. 过滤数据
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filtlong --min_length 2000 --min_mean_q 90 nanopore.fastq.gz | gzip >clean.filtlong.fq.gz
  1. 再质控
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NanoPlot --fastq clean.filtlong.fq.gz -o nanoplot_clean
  1. 使用三代测序软件进行拼接（flye、canu、wtbdg2等）
  2. 纠错

拼接结果优化

拼接结果优化，也就是纠错（polishing）。

Medeka

Medaka是由 Oxford Nanopore 开发的开源软件。使用时最好创建虚拟环境，否则容易报错。

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#进入虚拟环境运行
conda activate medaka
#运行软件
READ=../data/nanopore.sra.fastq.gz
medaka_consensus -i $READ -d assembly.fasta -o medaka_result -m r941_min_high_g360 -v medaka.vcf -t 24 >medaka.log

Pilon

Pilon 是由 broadinstitute 研究所开发的纠错工具，输入拼接结果（三代）以及原始测序数据（二代）比对到拼接结果（三代）的bam 文件即可。 输入的 bam 可以来自于二代测序数据的比对，也可以来自于三代测序数据比对得到的 bam，注意bam 文件需要排序并建立索引。并且Pilon在使用时要注意java使用的内存空间，修改Pilon.jar来增加上限，否则报错。

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#bwa建立索引
bwa index medaka.fasta
#使用bwa mem和illumina的测序结果比对得到sam文件
READ1=/ifs1/TestDatas/nanopore7/data/MGH78578/illumina.sra_1.fastq.gz READ2=/ifs1/TestDatas/nanopore7/data/MGH78578/illumina.sra_2.fastq.gz
bwa mem -t 4 -R '@RG\tID:foo\tSM:bar:\tPL:ILLUMINA' medaka.fasta $READ1 $READ2 >illumina.sam
#samtools排序并建立索引且转化为bam格式节省空间
samtools sort -@ 4 -O bam -o illumina.sorted.bam illumina.sam
samtools index illumina.sorted.bam
#Pilon
java -Xmx32G -jar /ifs1/Software/biosoft/pilon/pilon-1.23.jar --genome medaka.fasta --fix all --changes --frags illumina.sorted.bam --output pilon
--outdir pilon_result --threads 24 --vcf 2> pilon.log

Racon

Racon 是基于 minimap 和 miniasm 构建一致性序列(consensus)的一款软件，也可以用于纠错。既可以用于三代数据也可以用于二代数据。输入数据需要三个，首先是 contig，然后是测序的 reads，以及前面二者比对的结果，这个比对结果是 MHAP， PAF，SAM 三种格式当中的一种即可。数据结果为纠错后的 contig 序列。 Racon 纠错一般都会进行多轮。

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#连接原始拼接结果
DRAFT=../pilon/pilon_result/pilon.fasta READ=/ifs1/TestDatas/nanopore7/data/MGH78578/clean.filtlong.fq.gz
#minimap2 比对(bwa比对也可以)
minimap2 -t 4 ${DRAFT} ${READ} > round_1.paf
#racon 进行纠错
racon -t 4 ${READ} round_1.paf ${DRAFT} > racon_round1.fasta
#第二轮纠错
minimap2 -t 4 racon_round1.fasta ${READ} > round_2.paf
racon -t 4 ${READ} round_2.paf racon_round1.fasta> racon_round2.fasta
#第三轮纠错
minimap2 -t 4 racon_round2.fasta ${READ} > round_3.paf
racon -t 4 ${READ} round_3.paf racon_round2.fasta> racon_round3.fasta

特别注意

  • 一定要注意软件使用的范围，比如unicycler就只能拼接比较小的基因组比如细菌完成图